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[남궁석의 신약연구史]PD-1항체 개발 주역 'Medarex'

입력 2018-05-17 10:50 수정 2018-05-17 10:50

남궁석 충북대 교수

면역항암요법의 역사④ PD-1/PD-L1 발견, 역할규명 과정과 면역체크포인트 억제 항체의 개발

이번 연재에서는 CTLA-4와 함께 면역체크포인트 억제제의 타겟으로 각광받는 PD-1/PD-L1의 발견과정과 함께 이들을 저해하는 항체가 실제 의약품으로 개발되기까지의 난관을 알아보도록 하자. CTLA-4 와 마찬가지로 PD-1의 발견 과정도 처음에는 항암치료와는 무관한 기초 연구에서 우연히 파생된 것이라는 것에 주목할 필요가 있다.

세포자살에 관여하는 단백질을 찾으려다가 발견된 PD-1

교토 대학의 혼조 타스쿠(本庶佑, 1942 - )는 1970년대부터 항체의 클래스 스위칭(Class Switching) 과정 및 항체의 다양화를 유도하는 체세포 과변이(somatic hypermutation)에 관여하는 AID(activation induced deaminase) 등의 유전자를 발견하여 B세포가 어떻게 다양한 항체를 만드는지에 대한 분자생물학적인 기전을 규명하여 세계적인 명성을 얻었다.

타스쿠 연구실에서는 1980년대 말부터 연구실의 주 연구토픽인 B세포 이외에도 T세포의 인식의 다양성이 어떻게 생성되는가에 대한 의문을 풀기 위한 연구도 시작되었다. 1989년 당시 대학원생이던 이시다 야스마다(石田靖雅)는 지도교수에게 흉선에서 자신의 항원을 인식하는 T세포는 세포자살(apoptosis)를 통하여 제거되게 되는데, 여기에는 어떤 유전자가 관여하는지에 대한 연구를 하고 싶다고 제안하였다. 혼조는 해당 연구실에서 주로 진행되던 토픽과 거리가 있는 이 주제에 그다지 흥미를 느끼지 못했으나, 꽤 정교한 연구계획을 가져온 대학원생인 이시다에게 그 연구를 하고 싶으면 해보라고 하였다. 이시다는T 세포 하이브리도마에서 세포자살 시에 과발현되는 유전자를 탐색하여 유전자를 발견하였고, 발견된 유전자 중의 하나는 PD-1(Programmed Death-1)이라고 이름 붙여졌다. 그러나 PD-1의 서열은 기존에 알려졌던 세포자살에 관련된 유전자들과는 전혀 달랐고, CD28이나 CTLA-4 와 같이 이뮤노글로블린 슈퍼패밀리에 속하는 도메인을 가지고 있는 막 단백질이었다[1]. 더욱이 실망스럽게도 후속 연구를 통하여 PD-1 자체는 원래의 가설과는 달리 세포자살에 별다른 관여를 하지 않는다는 것이 알려졌다[2]. 그러나 PD-1의 진짜 기능을 밝히기 위한 연구는 이후에도 계속 이어졌다.

▲그림 1 : PD-1 유전자는 교토대학의 혼조 타스쿠 (좌) 연구실의 박사과정이었던 이시다 야스마사 (우, 현 NAIST 교수)에 의해서 발견되었다. 이시다는 원래 흉선에서 자가항원을 인식하는 T세포가 사멸되는 세포자살 과정에 관여하는 유전자를 발견하고자 시도하였고, 이를 통해 T세포 하이브리도마에서 PD-1 (Programmed Death-1) 이라는 유전자를 발견하였다. 그러나 이 유전자는 나중에 서포자살 과정에는 관여하지 않는다는 것이 밝혀졌다. PD-1 의 기능이 밝혀지는 것은 더 뒤의 일이었다.

면역체크포인트로의 PD-1 역할의 규명

일단 PD-1의 경우 B세포와 T세포 등의 세포 표면에 발현된다는 것이 알려졌고[2] PD-1의 생리학적인 기능을 밝히기 위하여 PD-1 유전자가 녹아웃된 마우스가 만들어졌고, PD-1이 녹아웃됨에 따라서 마우스에 어떤 이상이 생기는지를 관찰하려고 하였다[3]. 그러나 지난 연재에서 다룬 CTLA-4가 녹아웃된 유전자가 T세포의 과다한 증식으로 인해 태어난 후 한달 안에 사망한 데 반하여, PD-1 마우스는 겉보기에는 건강해 보여 어떤 이상을 보이는지를 알기가 힘들었다. 아마도 오랜 시간동안 PD-1 녹아웃 마우스를 만들고자 노력한 담당연구원들에게는 매우 힘빠지는 순간이었을 것이다.

그러나 이후에 나이가 든 PD-1 녹아웃 마우스에서는 루프스(Lupus)나 자가면역성 확장성 심근병증(autoimmune dilated cardiomyopathy) 등 여러가지 질병이 나타난다는 것이 알려지게 되었다[4,5]. 이러한 질병들의 공통점은 모두 자가면역에 관련된 질병, 즉 면역시스템이 지나치게 활성화되어 정상세포를 공격함으로써 나타나는 것이다. 즉, PD-1은 CTLA-4 와 마찬가지로 T세포의 활성을 조절하는 역할을 하는 단백질임이 PD-1 녹아웃 마우스를 통한 연구를 통해서 비로소 알려지게 되었고, 이는 PD-1 유전자가 최초로 발견된 이후 7년의 세월이 흐른 뒤였다.

그렇다면 CTLA-4와 PD-1은 T세포를 어떻게 조절하는가? CTLA-4는 지난 연재에서 설명한 것처럼 T세포의 CD28이 항원전시세포(APC:Antigen presenting cell)의 B7과 결합하여 T세포의 활성화를 개시한 이후 발현되어, T세포의 활성화 과정을 조절하고 세포주기를 조절하는 역할을 한다. 그러나 PD-1의 경우 이미 활성화된 T 세포의 활성을 더욱 조절하는 단계에서 이의 활성을 조절하는 역할을 하게된다는 차이가 있다. PD-1의 발견자인 혼조 타스쿠는 이의 역할을 다음과 같이 비유한다. 즉, CD28과 CTLA-4는 주차장에서 차를 빼거나 주차할 때 사용하는 엑셀레이터와 주차 브레이크라면 이미 활성화된 T세포에서 작동하는 ICOS(inducible co-stimulatory molecule)과 PD-1은 도로에서 차의 속도를 조절하는 엑셀레이터와 브레이크와 유사하다는 것이 그의 설명이다.

그렇다면 CTLA-4가 항원전시세포(APC:Antigen Presenting Cell) 표면의 단백질인 B7과 결합하여 활성화되듯이 PD-1과 상호작용하는 파트너는 무엇일까? 연구자들은 PD-1의 파트너는 B7과 상동성을 가지고 있을 것이라는 가설을 세웠고, B7과 상동성을 보이는 EST(Expression Sequence Tag) 데이터베이스의 상동 유전자를 검색하여(처음부터 cDNA라이브러리를 제조하여 미지의 클론을 찾았던 1980년대와는 달리 1990년대 후반에는 많은 동물 조직 유래의 RNA 시퀀스 데이터가 나와 이를 통하여 새로운 유전자가 발견되기 시작하였다) 아직 기능이 알려지지 않았지만 B7과 유사한 클론을 확인하고, 이것을 CHO 세포에 발현하여 PD-1 단백질과 결합하는지의 여부를 확인하여 새로운 유전자를 발견하였다[6]. 이 유전자는 PD-L1(PD-1 Ligand)로 명명되었고, B7과 마찬가지로 PD-1과 상호작용하여 T세포의 활성화에 기여함을 확인하였다. 그 이후 PD-1과 상호작용하는 리간드로 PD-L2 가 발견되었다[7].

APC에 국한되어 발현되는 B7과는 달리 PD-L1/PD-L2는 T세포, B세포, 마크로파지 혹은 수지상세포(Dendritic cells)과 같은 면역 관련 세포뿐만 아니라 혈관내피세포(Vascular endotherlial cells), 각질형성세포(Keratinocytes), 췌장세포 등의 다양한 세포의 표면에 발현하며 특히 여러가지 암세포에도 존재한다. 따라서 정상적인 상태에서는 PD-1/PD-L1-2의 상호작용에 의해서 T세포의 활성을 조절하며, 자신의 세포가 T세포로부터 공격받지 않도록 조절하게 된다. 그러나 여러가지 암세포에도 PD-L1이 발현되기 때문에 이는 동시에 암세포의 T세포에 의한 공격을 억제하는 역할을 하게 된다. 특히 만성 감염이 있는 상태에서 CD8 T세포가 APC 혹은 암세포로부터 항원 자극을 계속적으로 받으면, T 세포는 탈진(exhaustion) 된 상태로 빠져서 제 기능을 못하게 되며, 이 과정에서 PD-1/PD-L1의 상호작용이 결정적인 역할을 한다[8].

▲그림 2 : PD-1은 APC 혹은 다른 세포 (예 암세포) 표면에 있는 리간드인 PD-L1/L2 와 상호작용하여 T세포의 증식을 억제한다. CD8 T세포가 APC 혹은 암세포로부터 항원 자극을 계속적으로 받으면, T 세포는 탈진 (exhaustion) 된 상태로 빠져서 실제로 세포독성의 활성을 잃어버리며, 이 과정에서 PD-1/PD-L1 의 상호작용이 필수적이다. CTLA-4 의 리간드인 B7은 APC에만 존재하는 반면, PD-L1/L2 의 경우 APC뿐만 아니라 여러가지 면역세포 및 암세포의 표면에도 존재하여 T세포의 활성을 억제한다. 단백질 구조에서 보는 것처럼 B7과 PD-L1 은 구조적으로 유사한 단백질로써, CTLA-4/B7의 상호작용은 PD-1/PD-L1 의 상호작용과 흡사하게 이루어진다.

어쨌든 PD-1과 PD-L1/L2와의 상호작용에 의해서 T세포가 불활성된다는 발견은 앨리슨 랩에서 CTLA-4와 B7의 상호작용을 차단하여 면역세포 활성화의 억제를 풀어주는 것이 항암활성을 나타낸다는 결과처럼, PD-1과 PD-L1/L2와의 상호작용을 억제함으로써 암세포의 면역회피를 억제할 것이라는 아이디어로 이어졌고, 이는 2002년 마우스 모델에서의 실험으로 입증되었다. 혼조 연구실의 대학원생이었던 이와이 요시코(岩井佳子)가 제 1저자로 출판한 PNAS논문에서 이들은 PD-L1 을 과발현하는 암세포를 마우스에 주입하면 PD-L1 을 과발현하지 않는 암세포에 비해서 훨씬 빠르게 증식함을 보였다[9]. 그 이후에 PD-L1에 대한 항체를 같이 주입하면 이러한 빠른 증식이 사라짐을 보였다. 마지막으로 PD-1이 녹아웃된 마우스에 주입된 암세포는 PD-1 유전자가 존재하는 대조군에 비해서 오래 버티지 못하고 사라졌다. 이 결과는 PD-1과 PD-L1간의 상호작용을 억제함으로써 동물 모델에서 암 억제 효과를 얻을 수 있다는 것을 보여주는 결과였다.

특히 PD-L1은 APC에 국한된 B7에 비해 보다 다양한 세포에서 발현된다는 것은 큰 의미가 있다. 즉, 대개의 암세포에서는 B7을 발현하지 못하기 때문에 CTLA-4의 억제에 의한 항암 효과는 직접적으로 암세포와 반응하기보다는 APC와 조절 T세포를 거쳐 얻어지는 간접적인 효과이지만, PD-L1은 실제의 암세포에서 과발현되며, 따라서 암세포는 직접적으로 세포독성 T세포와 반응하여 이를 무력화시키고따라서 PD-1/PD-L1을 차단하는 것은 직접적으로 암세포를 공격 가능한 세포독성 T 세포를 유도할 수 있다는 장점이 있다.

▲그림 3: PD-1과 PD-L1간의 상호작용을 억제시킴으로써 암 항원을 인식하는 T세포의 무력화를 억제할 수 있게 된다. PD-1 에 특이적인 인간항체 nivolumab 은 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 억제함으로써 T세포의 활성화를 유발한다.

이렇게 하여 T세포의 활성화를 조절하는 단백질을 공략함으로써 암에 대한 항암활성을 유도할 수 있다는 개념증명(Proof of Concept) 수준의 동물 연구가 2000년대 초기까지 등장하였다. 그러나 이것은 어디까지나 마우스와 같은 실험동물에서의 연구였으며, 이것들이 어떻게 사람의 암을 치료하는데 보탬이 될지는 미지수였다. 특히 1990년대 중반까지 활발히 진행된 사이토카인이나 암 백신과 같이 면역계를 활성화하여 암을 치료하겠다는 수많은 시도들이 큰 성과를 거두지 못한 상황에서 CTLA-4/PD-1과 같은 단백질로 다시 한번 면역계를 활성화하여 암을 치료하겠다는 아이디어가 현실화되기 까지는 많은 난관을 극복해야 했다.

CTLA-4와 PD-1 항체 개발의 주역이 된 바이오텍 메다렉스(Medarex)

한편 1990년대 말 CTLA-4 를 억제하는 항체가 마우스에서 암 억제 효과를 보인다는 결과를 얻은 제임스 앨리슨은 이같은 발견을 실제로 인간의 임상에 적용하고자 여러 제약사와 접촉하였다. 그러나 1990년대에 진행되었으나 뚜렷한 결과를 얻지 못하고 실패한 여러가지 면역항암요법에 의한 시도 때문인지 대부분의 거대 제약사들은 앨리슨의 CTLA-4 결과를 인간에 적용하는데 매우 소극적이었다

그러나 넥스타 파마슈티컬(Nexstar Pharmaceutical)에 근무하던 면역학자 알란 코만(Alan Korman) 은 앨리슨의 결과를 듣고 매우 흥미있어했으며, 1998년 넥스타 파마슈티컬은 앨리슨이 UC 버클리에서 출원한 CTLA-4 억제 기술을 라이센싱하여 연구를 시작하였다[10].

여기서 면역항암제의 개발 과정에서 중요한 역할을 한 회사인 메다렉스 (Medarex)가 등장한다. 메다렉스는 1987년 다트마우스대학 의대 출신의 면역학자들에 의해 설립된 바이오텍 회사로서 1991년 IPO를 통하여 나스닥에 상장된 회사였다. 메다렉스가 다른 바이오텍에 비해서 가지는 강점이라면 1997년 인간의 이뮤노글로블린 유전자를 가지고 있는 형질전환 생쥐를 이용하여 생쥐에서 인간의 단일항원항체를 생산할 수 있는 플랫폼 기술[11]을 해당 기술을 개발한 젠팜(GenPharm)을 인수함으로써 확보한 것이었다. 이전의 허셉틴의 개발과정을 알아볼 때 다룬 것처럼 이때까지 상업화된 항체의약품은 대개 마우스 유래의 단일항원항체 유전자에서 항원 인식부위를 인간 항체에 이식하는 소위 ‘항체 인간화’ 기술을 이용하여 제조되었다. 그러나 메다렉스에서 확보한 이 기술을 이용하면 완전한 인간 항체를 형질전환 생쥐를 이용하여 마우스의 단일항원항체를 만드는 것과 동일한 방식으로 제조할 수 있게 되는 강점을 가지고 있었다.

메다렉스가 젠팜을 인수함에 따라서 형질전환 생쥐를 이용하여 인간항체를 생산하는 기술을 개발한 젠팜의 창립자 닐스 론버그(Nils Lonberg)는 메다렉스에서 근무하게 되었고, CTLA-4 에 대한 관심을 처음 가졌던 알란 코먼(Alan Korman) 역시 메다락스로 이적하고 앨리슨의 특허를 라이센싱하고, 메다렉스에서 확보한 형질전환 마우스를 이용한 인간항체 개발 플렛폼을 이용하여 CTLA-4에 대한 인간 항체 개발을 시작하였다[12].

이들은 인간 CTLA-4을 세포 표면에 발현하는 쥐 T세포 하이브리도마를 인간 IgG를 발현하는 형질전환 마우스에 주입하여 CTLA-4를 인식하는 인간 항체를 발현하는 하이브리도마를 발굴하였고 이는 MDX-010이라고 이름붙였다. 이 항체는 원숭이에서 안전성을 확인하였으며 면역 반응을 촉진하는 것 역시 확인되었다[13].

한편 태평양 건너편에서 혼조 타스쿠는 자신과 개인적으로 인연이 있던 제약회사인 오노약품과 함께 PD-1을 저해하는 면역항암요법에 대한 특허를 2002년 출원하고[14] 이를 실제로 가능케 할 인간/인간화 항체의 개발을 추진하려고 했다. 그러나 항체의약품, 그것도 면역 체크포인트라는 아직 검증되지 않은 타깃을 대상으로 하는 의약품을 개발하는 것에 대해서 모든 일본 제약사들은 회의적이었고, 심지어 특허를 공동출원한 오노약품조차 여기에 회의적이었다. 그러나 이들이 출원한 특허가 공개된 후 이를 검색을 통해서 인지한 메다렉스가 오노약품과의 공동 개발을 추진했고, PD-1에 대한 항체 역시 CTLA-4 에 대한 항체와 마찬가지로 메다렉스의 형질전환 마우스를 이용한 플랫폼을 이용하여 발굴되어 MDX1106이라는 코드네임이 붙여졌고, PD-L1에 대한 항체 역시 발굴되었다.

이렇게 2000년대 초에 이르러 CTLA-4 혹은 PD-1/PD-L1과 결합하는 인간항체(후에 Ipilimumab(상품명 YERVOY) 혹은 Nivolumab(상품명 Opdivo)로 판매되게 될)들의 발굴이 완료되었다. 그러나 이것이 실제로 임상시험을 통하여 임상적 유용성을 평가받고, 실제로 의약품으로 개발되기까지는 수많은 어려움을 극복해야 했었는데, 다음 연재 분에서는 이들이 어떠한 어려움을 극복하고 현재의 의약품이 되기까지의 과정을 살펴보도록 하자.

참고문헌

1. Ishida, Y., Agata, Y., Shibahara, K., & Honjo, T. (1992). Induced expression of PD‐1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death. The EMBO journal, 11(11), 3887-3895.

2. Agata, Y., Kawasaki, A., Nishimura, H., Ishida, Y., Tsubat, T., Yagita, H., & Honjo, T. (1996). Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes. International immunology, 8(5), 765-772.

3. Nishimura, H., Minato, N., Nakano, T., & Honjo, T. (1998). Immunological studies on PD-1 deficient mice: implication of PD-1 as a negative regulator for B cell responses. International immunology, 10(10), 1563-1572.

4. Nishimura, H., Nose, M., Hiai, H., Minato, N., & Honjo, T. (1999). Development of lupus-like autoimmune diseases by disruption of the PD-1 gene encoding an ITIM motif-carrying immunoreceptor. Immunity, 11(2), 141-151.

5. Nishimura, H., Okazaki, T., Tanaka, Y., Nakatani, K., Hara, M., Matsumori, A., ... & Honjo, T. (2001). Autoimmune dilated cardiomyopathy in PD-1 receptor-deficient mice. Science, 291(5502), 319-322.

6. Freeman, G. J., Long, A. J., Iwai, Y., Bourque, K., Chernova, T., Nishimura, H., ... & Horton, H. F. (2000). Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. Journal of Experimental Medicine, 192(7), 1027-1034.

7. Latchman, Y., Wood, C. R., Chernova, T., Chaudhary, D., Borde, M., Chernova, I., ... & Greenfield, E. A. (2001). PD-L2 is a second ligand for PD-1 and inhibits T cell activation. Nature immunology, 2(3), 261.

8. Barber, D. L., Wherry, E. J., Masopust, D., Zhu, B., Allison, J. P., Sharpe, A. H., ... & Ahmed, R. (2006). Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature, 439(7077), 682.

9. Iwai, Y., Ishida, M., Tanaka, Y., Okazaki, T., Honjo, T., & Minato, N. (2002). Involvement of PD-L1 on tumor cells in the escape from host immune system and tumor immunotherapy by PD-L1 blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences, 99(19), 12293-12297.

10. http://www.whatisbiotechnology.org/index.php/people/summary/Allison

11. Lonberg, N., Taylor, L. D., Harding, F. A., Trounstine, M., Higgins, K. M., Schramm, S. R., ... & Munoz-O'Regan, D. (1994). Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature, 368(6474), 856.

12. Lonberg, N., & Korman, A. J. (2017). Masterful antibodies: checkpoint blockade. Cancer immunology research, 5(4), 275-281.

13. Keler, T., Halk, E., Vitale, L., O’Neill, T., Blanset, D., Lee, S., ... & Korman, A. (2003). Activity and safety of CTLA-4 blockade combined with vaccines in cynomolgus macaques. The Journal of Immunology, 171(11), 6251-6259.

14. Honjo, T., Shibayama, S., Takeda, K., Matsuo, M., Yoshida, T., & Miyamoto, M. (2009). U.S. Patent No. 7,563,869. Washington, DC: U.S. Patent and Trademark Office.

15. Wang, C., Thudium, K. B., Han, M., Wang, X. T., Huang, H., Feingersh, D., ... & Singh, S. (2014). In vitro characterization of the anti-PD-1 antibody nivolumab, BMS-936558, and in vivo toxicology in non-human primates. Cancer immunology research, 2(9), 846-856.

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